CRISPR技术用于宠物疾病的快速诊断

宠物诊断是指利用生化、免疫、血液、分子等诊断技术，对宠物的传染性疾病，如猫鼻支、传染性腹膜炎、瘟热等或其他各种疾病进行检测，以达到及时治疗的目的。宠物疾病诊断市场上最普遍的诊断方法是进行免疫学诊断，如胶体金免疫层析测试、ELISA测试等。这些检测方法经济实用、覆盖面广，但通常敏感性和特异性较差，容易漏检或出现交叉造成假阳性，且受外界环境的影响较大。与免疫学诊断技术相比，分子诊断技术具有更高的灵敏度和特异性，使其在宠物疾病检测方面具有更明显的优势。目前常用的分子诊断方式是PCR技术，PCR技术虽然准确度高，但成本相对高，对检测环境、设备和人员的要求也严格，更适用于在医院或专业检测机构检测人类相关的疾病，在宠物诊疗中很难得到广泛应用。

01建立基于CRISPR的宠物疾病诊断方案

2023年8月14日，中国农业大学动物医学院张迪团队发表了一篇名为《Rapid and visual RPA-CRISPR/Cas12a detection for Staphylococcus pseudintermedius and methicillin-resistant S. pseudintermedius in clinical samples of dogs and cats》的文章，这项研究采用了结合重组聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a结合的分子诊断技术，建立了一种快速准确的宠物疾病诊断方法，以对犬和猫临床样本中的伪中间型葡萄球菌和甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌进行检测。与其他分子诊断法不同的是，该方法只需在恒温条件（37℃）下进行反应，40分钟便可读取测试结果，且不需要使用昂贵的仪器。

RPA-CRISPR/Cas12a的检测原理如下：使用DNA提取试剂从犬和猫的临床样本中快速提取伪中间型葡萄球菌spsJ基因和甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌mecA基因的基因组DNA。spsJ和mecA基因的DNA通过RPA扩增，扩增产物转移至含有靶向spsJ和mecA基因的特定crRNA的CRISPR/Cas12a检测系统中。与靶DNA结合的Cas12a-crRNA复合物激发了Cas12a蛋白的反式切割活性，并切割分别在两端标记FAM和BHQ1报告基团的ssDNA，从而在特定波长光的激发下产生可被检测的荧光信号（图1）。

图1.RPA-CRISPR/Cas12a的检测原理
02CRISPR检测宠物疾病的性能优势

在检测性能方面，为了评估RPA-CRISPR/Cas12a检测系统在宠物临床样本中的有效性，研究人员收集了47份来自犬猫皮肤和耳道的临床样本进行微生物培养，从培养的菌落中提取DNA，分别用RPA-CRISPR/Cas12a和PCR的方法对中间型葡萄球菌spsJ基因和甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌mecA基因进行检测。同时将培养提取DNA的扩增产物进行测序并将测序结果作为评价两种方法有效性的标准（图2）。

图2. 使用RPA-CRISPR/Cas12a方法检测宠物临床样本

检测结果表明：在所有采集的临床样本中，RPA-CRISPR/Cas12a方法的检测结果与临床培养后测序的结果完全一致（47/47）；而PCR方法的检测结果与测序结果的符合率为95%（45/47），这表明RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有较高的特异性（图3）。

图3. RPA-CRISPR/Cas12a检测spsJ和mecA基因的特异性

此外，研究人员对spsJ基因和mecA基因质粒进行稀释用于对比两种检测方法的灵敏度。反应管中的荧光强度反应了RPA-CRISPR/Cas12a的测试结果，PCR的测试结果则用凝胶电泳法显示。RPA-CRISPR/Cas12a对spsJ基因和mecA基因的检测限分别为10^3拷贝和10^4拷贝，其灵敏度均高于PCR的10^5拷贝（图4）。

图4. RPA-CRISPR/Cas12a检测spsJ和mecA基因的灵敏度

总结

CRISPR诊断技术的发展为宠物疾病的快速诊断提供了创新的解决方案。对于宠物疾病诊断而言，该分子诊断方法更加经济、便捷且高效，特别适用于即时诊断的检测场景，对预防宠物疾病和及时制定下一步的治疗方案具有重要意义。

参考文献：

[1].GAO, Pingping, et al. Rapid and visual RPA-CRISPR/Cas12a detection for Staphylococcus pseudintermedius and methicillin-resistant S. pseudintermedius in clinical samples of dogs and cats. One Health Advances, 2023, 1.1: 20.

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