RECCT-Cay——一种可在现场使用的自动化病原体检测平台（RPA）CRISPR/Cas12a检测法，用于检测人类粪便中的旋毛形线虫

     环孢子虫是一种可感染人体的寄生原虫，主要通过被污染的水源、生食果蔬传播，引发环孢子虫病，典型症状为水样腹泻、腹痛、乏力、食欲减退，病程常迁延数周。诊断多依靠粪便检查卵囊或PCR核酸检测，日常预防以注意饮食饮水卫生、彻底清洗果蔬为主。

本文提出了一种名为?RECCT-Cay? 的现场即时检测平台，用于检测人粪便中的?环孢子虫?。该方法结合了?重组酶聚合酶扩增? 和?CRISPR/Cas12a? 系统，旨在解决传统检测方法在偏远地区或现场应用中的局限性。

?一、研究背景与目标?

·?问题：? 环孢子虫是一种通过食源性和水源性传播的新兴肠道致病性原虫，在全球多地引起疾病爆发。目前常用的显微镜检查和PCR检测方法存在操作繁琐、耗时、需要专业实验室和人员、或灵敏度/特异性不足等问题，不适合现场即时检测。

·?目标：? 开发一种?快速、灵敏、特异且适用于现场?的POCT检测方法，用于环孢子虫的快速诊断。

?二、研究方法与技术原理?

1.?技术平台：? 建立了?RECCT-Cay? 检测平台。

o?第一步：? 使用?RPA? 在恒温（37°C）下快速扩增目标DNA（选择环孢子虫线粒体基因组中的 ?Cox3 基因? 作为靶点）。

o?第二步：? 利用?CRISPR/Cas12a? 系统进行检测。当Cas12a蛋白在crRNA引导下识别并切割目标DNA后，会激活其非特异性切割活性，进而切割带有荧光基团-淬灭基团或FAM-生物素标记的报告分子。

2.?结果判读：? 可通过两种方式直观读取结果：

o?荧光检测：? 在蓝光仪器下肉眼观察荧光信号。

o?侧向流动试纸条：? 通过试纸条上检测线是否显色进行判断。

3.?配套开发：? 设计并开发了一个?便携式手提箱?，集成了从样本采集、快速粪便DNA提取到RECCT-Cay检测所需的全部试剂（包括冻干试剂）和最小化设备，实现了“一站式”现场检测。

其中，使用了沃博生物的产品，CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条，货号JY0301。

?三、主要研究结果?

1.?高灵敏度：?

o对纯化DNA的检测限低至 ?7 拷贝/微升?。

o在模拟临床条件下（粪便样本），检测限为?每克粪便30个卵囊?。

2.?高特异性：? 该方法能有效区分环孢子虫与其亲缘关系密切的艾美耳球虫属物种，以及与其它常见肠道原虫（如刚地弓形虫、微小隐孢子虫等），无交叉反应。

3.?临床验证：? 对30份临床粪便样本进行检测，其结果与巢式PCR检测结果完全一致（3份阳性，27份阴性），证明了该平台的临床适用性。

4.?快速简便：? 整个检测过程可在约1小时内完成，且操作简单，无需复杂仪器和专业技术人员。

RECCT-Cay平台有哪些优势？

?1. 快速高效?

·整个检测过程（从样本处理到结果判读）可在?约1小时内?完成，远快于传统的PCR方法。

·采用?恒温扩增（RPA）?，无需复杂的温度循环设备，简化了操作流程。

?2. 高灵敏度与高特异性?

·?灵敏度高?：对纯化DNA的检测限低至?7拷贝/微升?；在模拟临床粪便样本中，检测限为?每克粪便30个卵囊?。

·?特异性强?：能够有效区分环孢子虫（Cyclospora cayetanensis）与其亲缘关系密切的艾美耳球虫属（Eimeria spp.）物种，以及其他常见肠道原虫（如弓形虫、隐孢子虫等），无交叉反应。

?3. 适用于现场即时检测（POCT）?

·?设备要求低?：核心反应在恒温（如37°C，可利用体温）下进行，无需昂贵的精密仪器（如PCR仪）。

·?结果可视化，操作简便?：

o可通过?便携式蓝光仪器?肉眼观察荧光信号。

o可使用?侧向流动试纸条?进行结果判读，无需专业技术人员。

·?集成化便携设计?：研究配套开发了一个?便携式手提箱?，集成了从样本采集、快速DNA提取到检测所需的全部冻干试剂和最小化设备（如移液器、恒温金属浴），实现了“一站式”现场检测。

?4. 技术先进性与可靠性?

·?技术组合创新?：首次将?RPA恒温扩增?与高特异性的?CRISPR/Cas12a?系统结合用于环孢子虫检测。

·?临床验证一致?：对30份临床粪便样本的检测结果与巢式PCR结果完全一致，证明了其临床应用的可靠性。

?四、局限性?

1.RPA试剂成本相对较高。

2.目前采用RPA与CRISPR/Cas12a分步反应，开管步骤有气溶胶污染风险，未来可优化为单管反应。

3.粪便基因组DNA的快速提取效率仍有提升空间。

?五、结论与意义?

       本研究首次成功将RPA与CRISPR/Cas12a技术结合，应用于环孢子虫的检测。所构建的 ?RECCT-Cay平台?具有?快速、高灵敏度、高特异性、设备要求低、结果可视化的优点?。配合开发的便携式手提箱，该技术特别适用于?诊所、偏远地区或现场环境?下环孢子虫的初步筛查和诊断，为未来POCT技术的发展提供了重要参考。

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