周小明团队开发光控CRISPR检测技术用于新冠检测

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的大范围爆发，引发了全球公共卫生危机并对世界经济造成了沉重的打击，准确的早期诊断是打破传播链、降低传染病影响的最有效方法。目前，国外对居家（基层）核酸检测技术的研发正在如火如荼的开展，如美国Detect Inc.开发的DetectTM COVID-19 test, 美国Lucira Health公司开发的LuciraTM Check it COVID-19 test kit, 和美国雅培研发的ABBOTT COVID-19 test等已经获批开始销售。而在国内，居家（基层）核酸检测技术尚处于发展阶段，目前尚无成熟的商业化产品问世，因此加速开发新一代居家（基层）核酸检测技术具有重要社会效益和经济价值。近年来，CRISPR/Cas系统因其精确的基因识别，恒温的反应条件、易设计和易操作等特点，在核酸诊断领域得以高速发展。其中，DETECTR[1]（DNA Endonuclease Targeted CRISPR trans Reporter）、HOLMES[2]（an one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System）和SHERLOCK[3]（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing）等基于CRISPR/Cas系统和等温扩增技术的核酸诊断方法受到了广泛的关注。但这些核酸诊断技术是将核酸扩增过程和CRISPR检测过程分步进行的，从而增加了检测步骤的复杂性、增大了样本交叉污染的风险。因此，核酸等温扩增和CRISPR检测的兼容性问题是CRISPR诊断技术商业化应用的一个关键障碍。

2022年6月21日，华南师范大学生命科学学院周小明研究员团队在国际学术期刊PNAS上发表了题为“Photocontrolled crRNA activation enables robust CRISPR-Cas12a diagnostics”的研究。该研究首次将光响应技术引入到基于CRISPR系统的核酸检测中，解决了核酸等温扩增与CRISPR检测的兼容性问题，实现了封闭、无需开盖转移试剂，高灵敏的核酸检测。

此前的研究表明，CRISPR-Cas9系统的基因编辑可以通过光照射的方式进行调控[4-8]。这些调控方法主要分为两大类，第一类是通过位点特异性的嵌入一个光笼化的氨基酸来阻断Cas9蛋白的功能，第二类是通过沉默其引导RNA实现Cas9蛋白活性的沉默。与Cas9系统不同，Cas12系统具有顺式和反式的DNA识别裂解机制。近期，一种光控方法被开发用于调控Cas12a的表达及其基因编辑[9]。但直接光调控Cas12系统顺式和反式切割活性的报道尚未可见。进一步的，考虑到Cas12a系统在新一代核酸检测中的巨大潜力，作者试图实现其顺式和反式切割活性的光调控，构建光控CRISPR-Cas12a系统。crRNA在LbCas12a系统的活性激活过程中起着不可或缺的作用，因此，作者推断阻断crRNA与靶标之间的碱基互补配对能够沉默Cas12a系统的活性。进一步的，Cas12a系统对于RNA靶标具有较低的切割活性。基于此，作者设计了四种保护性RNA（p-RNAs）（6PC、3PC、2PC和R5-3PC）来评估它们的沉默效果。实验结果发现，当R5-3PC序列与crRNA的加入比例为2 : 1时，能够完全阻断Cas12a的反式切割活性（图1）。进一步的实验结果表明，30 s的光照射时间足以使p-RNA从crRNA上脱离，从而使得Cas12a活性完全恢复。

图1 光控CRISPR-Cas12a检测概念的设计和验证

（图源：Hu, et al., PNAS, 2022）

近年来，因CRISPR-Cas12a系统与等温扩增技术的集成可以显著提高常规方法的灵敏度和特异性，促使基于CRISPR-Cas12a系统的核酸检测技术得以高速发展。然而，这两种反应体系之间的不兼容性，极大地阻碍了其商业化应用。例如，在常规的一管式RPA-CRISPR-Cas12a DNA检测中，CRISPR-Cas12a系统的顺式和反式裂解反应会导致RPA反应所需的模板和引物被降解，进而使得整体反应的检测效率降低。而物理分割RPA反应和CRISPR-Cas12a检测反应很容易导致气溶胶污染。本研究中，作者将上述光控Cas12a系统整合到常规的RPA-CRISPR/Cas12a一管法检测体系中，通过暂时阻断体系中的Cas12a系统的活性，成功解决了核酸等温扩增与CRISPR检测体系之间的兼容性问题。研究结果表明，光控一管法的检测灵敏度比常规一管法高出至少两个数量级，并与传统两步法的灵敏度相当（图2）。

图2 光控RPA-CRISPR-Cas12a一管法的开发

（图源：Hu, et al., PNAS, 2022）

由于光控一管法的检测灵敏度显著提高，作者进一步将其用于开发一种严重呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）RNA检测方法。在对60例SARS-CoV-2临床样本的检测中，光控一管法能够可靠地检测出所有Ct值小于等于37的样本。对于Ct小于或等于38的样本，光控一管法对O基因和N基因分析的灵敏度分别达到了100%和95.6%。当Ct值小于或等于40时，检测灵敏度也大于90%（图3）。综合上述实验结果，光控一管法达到了非常接近于金标准qRT-PCR检测的灵敏度。

图3 光控RPA-CRISPR-Cas12a一管法检测SARS-CoV-2临床RNA样本

（图源：Hu, et al., PNAS, 2022）

最后，为了促进该技术的推广和商业化，作者设计并构建了一套紧凑型光控CRISPR检测设备。整体设备操作简单，在将反应管放入样品台后，点击START按钮，即可自动执行RPA扩增，紫外激发和CRISPR检测程序。程序结束后，触摸屏上将同时显示反应管的荧光成像照片和荧光曲线变化的实时结果，对应阳性和阴性结果的判读也会同步进行显示。为了验证所构建检测设备的是否可以正常运行，研究人员使用该装置同时检测了一组阳性和阴性样品。典型实验结果如图4E&F所示，该检测设备在对阳性样品的检测中采集到了明显的荧光曲线的变化，同时在荧光成像照片中也能观察到明显的荧光图像，而在阴性样品中没有观察到明显的变化。

图4 紧凑型光控RPA-CRISPR-Cas12a一管法检测装置的构建

（图源：Hu, et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望：

综上所述，本研究发明了一种光控CRISPR检测技术。通过引入一个含有PC-linker的保护性寡核苷酸链，实现了CRISPR/Cas12a活性的暂时沉默。如此，在一管RPA-CRISPR/Cas12a检测系统中，可以将RPA扩增与CRISPR/Cas12a检测在时间维度上分离，避免了CRISPR系统的裂解活性造成的扩增抑制。在对60份临床SARS-CoV-2 RNA样本的O-gene和N-gene的分析中，光控一管法取得了良好的检测灵敏度和特异性。鉴于现有版本的光控CRISPR检测系统仍处于开发的早期阶段，作者认为在对所有试剂和反应条件进行系统的优化后，将会达到与PCR相同甚至更优越的检测性能。光控策略是一种简单、通用和高效的解决等温扩增和CRISPR检测的兼容性问题的方法，为CRISPR技术的商业化应用扫清了一个关键障碍。此外，作者所展示的光控CRISPR检测装置，进一步证明了光控一管法的自动化的发展前景。最后，本研究虽仅仅展示了一管RPA-CRISPR-Cas12a技术的改进，但很明显，目前的光控技术也可以应用于其它等温扩增技术，如LAMP和EXPER，以及其它CRISPR检测系统，如CRISPR-Cas13。

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