一步法快速检测乙型流感病毒的新技术-Fast-Flu

一、研究背景

乙型流感病毒（Flu B）是一种极具传染性的呼吸道病原体，每年会引发大量感染和死亡病例，尤其在冬季高发，还可能导致脑炎、细菌性肺炎等严重并发症。目前，虽有疫苗和抗病毒药物，但 Flu B 的抗原变异使其效果受限，因此急需快速准确的诊断方法。

传统的 Flu B 诊断方法，如病毒分离、抗原检测和血清学检测，耗时较长，无法满足快速诊断的需求。近年来，基于 PCR 的分子诊断方法广泛应用，但存在依赖昂贵设备、需要专业技术人员操作以及反应时间长等缺点。等温扩增技术，像环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA），能在恒温下进行，无需特殊热循环设备和大量消耗试剂，不过非特异性扩增产物会影响其特异性。

CRISPR/Cas 系统原本用于基因组编辑，现在也用于核酸检测，具有高特异性和敏感性，能识别单碱基错配。RPA 与 CRISPR/Cas 系统结合可实现高灵敏度和特异性的核酸检测，但现有基于 CRISPR 的流感检测平台，在将扩增产物转移到 CRISPR/Cas12a 检测系统时，需开盖操作，增加了交叉污染风险。本研究旨在开发一种一步法逆转录重组酶聚合酶扩增 - CRISPR/Cas12a（RT - RPA - CRISPR/Cas12a）Flu B 检测系统，优化反应温度和 Cas12a 浓度，减少 Cas12a 顺式切割对模板和扩增产物的影响，提高检测灵敏度，为 Flu B 及其他病原体检测提供参考。

二、材料与方法

• RPA 引物设计与筛选：从 NCBI 数据库下载 Flu B 核酸序列，根据特定保守区域设计 3 条正向（F1 - F3）和 3 条反向（R1 - R3）RPA 引物，由生工生物合成。用购买的 Flu B 假病毒产品提取的 RNA 作模板，将引物两两组合，用商业试剂盒进行 RPA 扩增，扩增条件为 38°C 孵育 30 分钟，1000 copies / 测试 RNA 模板。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物质量，筛选最佳引物组合。

• crRNA 设计与筛选：根据选定引物序列，设计 6 条 Cas12a crRNA（crRNA1 - crRNA6），由商业试剂盒合成。在一锅法 Flu B 检测系统中评估筛选，选择检测效率最高的 crRNA 用于后续实验。

• 一锅法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系统条件优化：一锅法 Flu B 检测系统包括 RT - RPA 扩增和 CRISPR/Cas12a 检测两部分。RT - RPA 反应总体积 24μL，含特定浓度引物、RNA 模板、激活剂和无核酸酶水，在 38°C 反应 30 分钟。CRISPR/Cas12a 检测系统总体积 10μL，含特定缓冲液、Lb5Cas12a、crRNA 和单链 DNA（ssDNA）报告探针，在不同温度下孵育 10 分钟，设置不同工作温度、Cas12a 浓度、crRNA6 浓度和 ssDNA 探针类型进行优化，收集荧光强度数据。

• 一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系统条件优化：一步法 Flu B 检测系统总体积 25μL，包含多种试剂。设置不同工作温度、Cas12a 浓度、crRNA6 浓度和 ssDNA 探针类型，在不同温度下反应 45 分钟，每分钟收集荧光信号进行优化。

• 敏感性分析：构建含 Flu B 片段的重组质粒，稀释为不同浓度（200 copies / 测试、100 copies / 测试、50 copies / 测试、25 copies / 测试），每个浓度进行 10 次重复反应。用 Sigmoid 函数根据阳性结果预测一步法检测的最低检测限（LOD）。

• 特异性检测：收集 6 种干扰样本（A 群链球菌（GAS）、鲍曼不动杆菌（AB）、人副流感病毒（HPIV）、肺炎支原体（MP）、肺炎克雷伯菌（KP）和 H1N1 禽流感病毒（H1N）），以 Flu B 假病毒核酸为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照，用一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 检测系统进行检测，每个样本重复 3 次。

• 临床样本验证：淮北人民医院提供 101 份咽拭子样本，用商业试剂盒提取 RNA 作模板进行 RT - RPA 反应。同时用一锅法和一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 方法检测样本，以 PCR 方法检测结果为金标准，分析两种方法与 PCR 方法的一致性。

• 数据处理与统计分析：检测结果用相对荧光倍数表示，每个样本至少检测 3 次生物学重复，数据以平均值 ± 标准差表示。用 GraphPad Prism 10 软件进行统计分析，通过 Student’s t 检验评估统计学差异，用 Sigmoid 函数预测 LOD，P < 0.05 为差异有统计学意义。

  
  

三、研究结果

• 检测系统工作流程：一锅法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a Flu B 检测系统中，RT - RPA 反应在管底进行，CRISPR/Cas12a 检测系统在管盖准备。Flu B 靶序列经 RT - RPA 扩增后，通过短时间离心将 CRISPR/Cas12a 检测系统混入 RT - RPA 反应体系，借助 FAM 标记的 ssDNA 探针释放荧光信号，40 分钟内可完成检测。一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系统将两种检测试剂整合在一个反应中，45 分钟内完成反应并在荧光信号检测仪上分析。

• 引物和 crRNA 筛选结果：通过琼脂糖凝胶电泳评估 9 种引物组合的扩增产物，确定 F1/R2 为最佳引物组合。在一锅法检测系统中筛选 6 条 crRNA，发现 crRNA6 检测效率最高，因此选择 crRNA6 用于后续实验。

• 系统条件优化结果：一锅法系统中，确定 Cas12a 最佳工作温度为 42°C，最佳浓度为 250nM，P8C 的 ssDNA FAM 标记探针性能最佳。一步法系统中，最佳反应温度为 40°C，Cas12a 最佳浓度为 125nM。

• 敏感性和特异性检测结果：一锅法和一步法检测系统对不同浓度重组质粒的检测结果显示，两者检测率相同，一步法检测系统的 LOD 为 58 copies / 测试。特异性检测中，只有阳性对照样本产生明显荧光信号，干扰样本无明显信号，表明一步法检测系统对 Flu B 检测特异性高，无交叉反应。

• 临床样本验证结果：101 份临床咽拭子样本检测结果显示，一锅法检测系统敏感性为 81.25%，特异性为 98.82%，与 PCR 方法一致性为 96.03%；一步法检测系统敏感性为 56.25%，特异性为 100%，与 PCR 方法一致性为 93.06%。

  
  

四、讨论

本研究开发的一步法 Flu B 检测系统，整合 RT - RPA 和 CRISPR/Cas12a 技术，能在 45 分钟内特异性识别 Flu B，LOD 为 58 copies / 测试。与 PCR 方法相比，该系统特异性高（100%），总体一致性达 93.06%，有助于 Flu B 的早期诊断和精准治疗。

目前基于 RT - RPA 的平台虽能在 1 小时内筛查流感病毒和新冠病毒，敏感性可达 10 copies 病毒 RNA，但非特异性扩增产物导致的假阳性限制了其应用。基于 RPA - CRISPR/Cas12a 的 Flu B 检测方法敏感性虽高，但多为两步法，需开盖操作，增加气溶胶污染风险，操作复杂，不利于临床应用。本研究的一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系统在单管内完成所有反应，无需开盖，避免气溶胶污染，成本降低 75%，主要通过减少反应体积和降低 Cas12a 浓度实现，同时抑制了 Cas12a 的顺式切割活性。

与 PCR 相比，PCR 的高 Ct 值会导致 “灰色地带” 问题，而本研究的一锅法和一步法检测系统在临床样本中特异性和一致性高，有效避免该问题。不过，一步法检测系统在临床样本中的敏感性（56.25%）低于一锅法（81.25%），可能与单一反应条件和临床样本中病毒载量低有关，且本研究临床样本数量有限，后续需扩大样本量验证。

此外，Cas12a 的顺式切割活性影响一步法反应的敏感性，本研究通过优化反应温度和 Cas12a 浓度降低其影响。同时，其他技术如光控 crRNA 激活系统和基于水凝胶的检测平台等不断发展，有望进一步提高一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系统检测 Flu B 及其他 RNA 病毒的性能。

综上所述，本研究开发的一锅、一步法 Flu B 检测系统，操作简便、快速准确、无污染，所有试剂可冻干预制备，为 Flu B 的即时诊断奠定基础，也为一步法 CRISPR/Cas 系统在其他病原体分子诊断中的应用提供参考。

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