基于CRISPR/Cas13a技术检测乙型肝炎病毒DNA方法

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝DNA病毒，可导致急性或慢性肝病，严重时可能会引发肝硬化、肝衰竭甚至肝癌  。HBV通过血液、母婴传播和性接触进行传播，全球已有超过2亿人感染，其中部分人发展为慢性乙型肝炎。作为病毒复制和传染性的直接标志，HBV DNA检测在评估病毒传染性和抗病毒疗效方面至关重要  。尽管实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）已广泛用于HBV DNA的检测，但该方法也存在一些缺陷  ，例如检测周期较长、需要大型设备等。因此，HBV DNA检测在提高检测灵敏度和检测速度等方面仍需进一步改进。

本研究旨在基于RAA-CRISPR/Cas13a系统建立一种快速、灵敏且特异性良好的HBV DNA检测方法，为临床监测HBV的感染以及评估治疗效果提供了新的思路。

实验方法：

1.试剂与仪器：HBV DNA阳性质粒（博迈德生物科技有限公司）；HBV国际标准品（英国国家生物标准与控制研究所）；琼脂糖（索莱宝科技有限公司）；Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液和GoldenViewTM（博迈德生物科技有限公司）；TIANamp病毒DNA/RNA提取试剂盒（天根生物技术有限公司）；RAA核酸扩增试剂盒和逆转录-重组酶介导的等温扩增试剂盒（众测生物科技有限公司）；乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（圣湘生物）；凝胶成像仪和 PCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）；Roche Light Cycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪器（瑞士罗氏公司）。

2. HBV DNA 质粒的构建：从HBV数据库（ https：//hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/HBVdbIndex）中下载了全长HBV DNA序列。使用Jalview软件比较了HBV-P区序列。比较后，选择具有95%以上保守性的HBV DNA序列，然后以含有部分 HBV 基因组的质粒（GenBank ID：LC456126.1 位点：625~758）和 pUC57 为模板构建HBV DNA阳性质粒，并根据保守序列设计crRNA和RAA引物。HBV保守序列筛查结果：5′-TTTCGCAAAATT CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGG-3′（134 bp）。

3. CRISPR-Cas13a体系检测HBV DNA的原理及构建：从临床样本的血浆中提取总HBV DNA，使用筛选出来的RAA引物对靶向的HBV DNA区域进行RAA扩增，然后通过T7转录将其转化为单链RNA（single strand RNA，ssRNA）。在Cas13a检测系统中，目的ssRNA片段可以被Cas13-crRNA复合物特异性识别和结合，以触发Cas13a活性并切割荧光报告探针释放荧光信号，这些荧光信号可以通过荧光仪器进行检测并获得荧光信号的强弱，从而反映出样本中HBV DNA的存在。整个检测流程大约需要1 h。

4. RAA引物和crRNA设计：从已获得的HBV保守序列中设计3 对特异性的RAA 扩增引物和3 条 crRNA 序列（ 表1 、 2 ）。所有序列由上海生工生物技术有限公司合成。

5.血浆HBV DNA的提取：使用TIANamp病毒DNA/RNA试剂盒从HBV阳性患者血浆样本中提取20 μl HBV DNA，提取的HBV DNA存放在-80 ℃冰箱备用。

6. DNA琼脂糖电泳：将1 g琼脂糖与100 ml 1×Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液混合，加热溶解后冷却至50~60 ℃，然后加入10 μl GoldenView TM核酸染料。将RAA扩增产物上样凝胶孔后，在170 V电泳约20 min，取出凝胶块并放入凝胶成像仪中进行检查和图像保存。

7. RAA引物和crRNA的筛选：使用3对引物分别对10 3拷贝/μl的阳性质粒进行RAA扩增，通过观察CRISPR-Cas13a检测的荧光信号值筛选扩增效率最高的RAA引物。10 3拷贝/μl的阳性质粒分别使用crRNA1、crRNA2和crRNA3进行CRISPR-Cas13a检测，观察反应结束时（60 min）的荧光强度，筛选检测效率最高的crRNA做后续实验。

8. RAA 扩增：RAA核酸扩增试剂盒反应总体积为50 μl，其中上游引物（10 mmol/L）、下游引物（10 mmol/L）和 MgCl 2各2 μl，DNA 模板5 μl。反应条件为 37 ℃ 30 min，阴性对照为无酶无菌水。

9. CRISPR-Cas13a检测：CRISPR-Cas13a检测体系包括：NTP混合物（2.5 mmol/L）2 μl，LwCas13a蛋白（25 nmol/L）1 μl，RNA酶抑制剂1 μl，T7 RNA聚合酶0.5 μl，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（20 mmol/L）0.5 μl，MgCl 2溶液（10 mmol/L）0.25 μl，crRNA（2 μmol/L）1.5 μl，荧光报告RNA（2 nmol/L）2.5 μl，无酶无菌水（ddH 2O）10.75 μl，扩增产物5 μl，总体积25 μl。其中crRNA序列为：GGGGAU UUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUACGAACCACUGAACAAAUGGCACUAGU，反应条件为 37 ℃ 1 h，阴性对照为无酶无菌水。

10.灵敏度评价：使用梯度稀释HBV国际标准品（初始浓度为1×10 6 IU/ml，稀释为1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0和1×10 -1 IU/ml）和HBV阳性临床样本（1×10 6、1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0 IU/ml和未检测到HBV DNA）作为检测模板，利用已建立的CRISPR-Cas13a检测方法在不同的时间点进行3次以上的重复实验，每次运行2个重复（复孔）。

11.特异性评价：为评价CRISPR-Cas13a系统检测HBV DNA的特异性，本研究收集了其他常见的传染性疾病的阳性临床样本各6例（HDV、HEV和HIV），提取总RNA后，通过逆转录-重组酶介导的等温扩增技术后的扩增产物作为检测模板进行交叉反应。该试验在不同的时间点重复3次，每次运行2个重复。

12. qPCR检测：使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒对不同病毒载量的HBV DNA阳性患者样本进行qPCR检测。反应条件：95 ℃ 5 min热变性；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃自动延伸10 min。根据Ct值判断结果：Ct值≤35为阳性，35<Ct值<40需重新检测确认，Ct值无结果或>40为阴性。

13.统计学分析：应用GraphPad prism 8.0版本进行统计学分析。正态分布的连续变量采用表示，多组间的比较采用方差分析和Tukey多重比较检验，2组间的比较采用配对 t检验。双侧检验， P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果：

一、RAA引物和crRNA筛选琼脂糖凝胶电泳验证了9组RAA引物（F1、F2、F3和R1、R2、R3排列组合）的可用性和扩增效率。根据亮度结果（ 图1 ），HBV-RAA-F2、HBV-RAA-R2配对的RAA引物对表现出最佳的扩增效率（17 602.2±1 437.2），与阴性对照（5 791.64±472.8）差异有统计学意义（ t=11.04， P<0.01）。crRNA1、crRNA2和crRNA3的荧光强度分别为200.7±9.9、181.1±8.8和229.0±4.3，其中crRNA3的荧光值均高于crRNA1（ t=4.536， P<0.01）和crRNA2（ t=8.479， P<0.01），使用crRNA3用于后续检测（ 图2 ）。

二、灵敏度和特异性的评价使用CRISPR-Cas13a检测60 min时，1×10 0 IU/ml的HBV DNA荧光强度（23.7±11.5）与阴性对照（1.8±0.3）差异有统计学意义（ t=47.96， P<0.01）（ 图3A ）。反应进行 60 min 时，HBV阳性患者样本的检测相对荧光值与阴性对照的荧光值分别为196.3±7.6和4.8±1.1，差异有统计学意义（ t=13.63， P<0.01）。HIV、HEV、HDV阳性患者样本的检测荧光值分别为5.4±1.5、4.9±1.6和5.0±1.0，与阴性对照的荧光值差异均无统计学意义（均 P>0.05， 图3B ）。因此，该法检测HBV DNA标准品的灵敏度可达到1×10 0 IU/ml。

实验讨论：

本研究将RAA与CRISPR检测相结合建立了RAA-CRISPR 的精准检测HBV DNA的方法，建立的检测方法对HBV DNA阳性标准品的检测灵敏度为1 IU/ml；对 HBV DNA 阳性样本的检测灵敏度也达到<10 IU/ml。本研究还对70 个HBV DNA阳性临床标本进行检测，结果显示，CRISPR-Cas13a 检测 HBV DNA的阳性率为 100%（70/70）。与qPCR检测系统比较，CRISPR-Cas13a系统能更快地检测出HBV DNA阳性患者。本研究建立的检测方法可以快速精准地检测HBV DNA，但也存在一些不足之处。由于 CRISPR系统的“附带切割”具有非特异性，即切割持续且随机，因此对HBV DNA只能进行定性检测，无法定量分析。本研究将RAA快速扩增与CRISPR-Cas13a相结合检测HBV DNA，灵敏度高、特异性好。该方法还有望替代目前基于qPCR的 HBV DNA诊断方法，降低HBV检测成本且有助于临床HBV患者的早期干预，推动乙型肝炎的诊断和管理，为未来HBV的POCT检测提供方向。

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