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应用于重组蛋白纯化检测一一PA标签系统

发表时间：2023-05-05

PA-Taq新型亲和标签系统（日本wako）是利用单克隆抗体（NZ-1）识别肽标签（GVAMPGAEDDVV）的高亲和性&高特异性的亲和纯化标签系统。PA tag 系统的亲和性特异性优于现有标签系统，抗体微珠可再生40-60次，可用于免疫细胞化学、免疫印迹和流式细胞术，是动物宿主细胞重组蛋白生产中的有效工具。

◆特点

● 通过树脂再生，降低运行成本

● 超高亲和性抗体，实现高回收率、高纯度纯化

● 在动物细胞表达系（HEK293T细胞、CHO细胞等）中，有效纯化蛋白

● PA标签系统是使用可识别肽标签（12个氨基酸残基）的单抗（NZ-1）。日本开发的亲和性纯化标签系统。

● NZ-1单抗对PA tag具有高亲和性和特异性，可应用于Western Blotting、细胞流式分析、免疫组化（ICC）。

通过免疫沉淀，可纯化PA标签融合蛋白以及树脂再生。

● PA标签系统，可一步纯化高纯度PA标签融合蛋白。

◆PA标签系统

Fujii, Y. et al., "PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.", Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).

Fujii, Y. et al.
新型亲和标签系统“PA tag”的应用方法~蛋白的纯化及检测~ 蛋白科学学会档案, 7, e075 (2014)

◆PA标签表达载体案例

载体	表达模式	宿主细胞	MCS启动子
pCAG	瞬时表达	灵长类（人、猴）、犬细胞等粘着细胞和啮齿动物细胞	CAG

◆用PA标签从培养上清中亲和提纯的案例

数据提供：大阪大学蛋白研究所附属蛋白分析先进研究中心

分子创制学研究室高木淳一老师，藤井勇树老师

◆Protocol目的蛋白的纯化

１．哺乳类动物细胞转染(HEK293T)
转染处于40-60%融合状态的细胞
培养基：D-MEM, 5%FBS

２．回收培养上清和吸附蛋白树脂
转染48-72小时后，回收约420 mL培养上清，加入8 mL抗PA标签抗体琼脂糖珠，混合2小时（2-10℃）

３．树脂回收
用50 mL的纯化柱。回收步骤2)中的琼脂糖珠

４．树脂洗涤
加入珠4倍量的TBS 缓冲液（20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl），清洗5次

５．PA标签肽从树脂中竞争性洗脱
加入经1×TBS溶液, pH 7.5溶解过的PA 标签肽（终浓度0.1 mg/mL），体积量需为珠的一倍，

然后分10次回收PA标签融合蛋白X

６．SDS-PAGE
样品量
c. sup：5 μL, flow through：5 μL, wash：5 μL,
肽洗脱（1-10）：各10 μL

可纯化PA标签融合蛋白X且不依赖PA标签。→可实现极高纯度的亲和纯化。

◆通过PA tag降低背景的方法

M: Marker
I: input 100ng分
P: 纯化前样品
1: wash片段①
2: wash片段②
3: wash片段③
4: wash片段④
5: wash片段⑤
6: wash片段⑥
7: wash片段⑦
8: wash片段⑧
9: wash片段⑨
10: 酸洗脱①
11: 酸洗脱②
12: 酸洗脱③
13: 酸洗脱④
14: 酸洗脱⑤

在20 mL的昆虫细胞溶解液中加入蛋白Z，使其浓度变为1.0 mg/L后，添加200 μL抗PA标签抗体琼脂糖珠，4℃温度条件下，搅拌3小时。

分别用不同浓度的TBS溶液（0.15 M、0.5 M、1.0 M NaCl）进行调整，用琼脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)，室温条件下平稳震动5 min。

离心后回收上清，用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和处理。

SDS-PAGE后进行银染，比较去除污染蛋白之后，不同浓度下的结果。

◆使用案例：Western Blotting

地域革新领域加藤幸成老师，金子美华老师

NZ-1显示出与天然抗体具有相同的高检测灵敏度。

Lane 1

一抗：抗IDH1抗体（RcMab-1）, 1 μg/mL

二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释

Lane 2

一抗：抗PA tag抗体, 1 μg/mL

二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释

Lane 3

一抗：抗DYKDDDDK标签抗体, 3.5 μg/mL

二次抗体：抗小鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释

样品量：各10 μg
曝光时间：10分钟

◆PA标签系列

产品名称	子类克隆号	适用实验	规格	产品编号	包装
单抗
抗PA标签, 大鼠单抗 Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody	大鼠IgG2a NZ-1	IP, WB, FCM, ICC	免疫化学用		200 μL
					1 mL
HRP标签单抗
抗PA标签, 大鼠单抗,过氧化酶结合 Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated	大鼠IgG2a NZ-1	WB	免疫化学用		200 μL
					1 mL

产品名称	子类克隆号	规格	产品编号	包装
抗体结合琼脂糖珠
抗PA标签抗体琼脂糖珠 Anti PA tag Antibody Beads	大鼠IgG2a NZ-1	免疫化学用		2 mL(Net 1 mL)
				10 mL (Net 5 mL)
				50 mL (Net 25 mL)
识别N端、C端的PA标签使用载体：4% 琼脂糖溶液组成：1 x PBS (pH7.2), 0.05 w/v%叠氮化钠抗体结合量：参见标签记载结合容量：1 mL本品可结合约0.015-1.0 mg的PA标签融合蛋白
抗体结合磁珠
MagCaptureTM HP 抗PA标签抗体磁珠 MagCapture? HP Anti PA tag Antibody Magnetic Beads	大鼠IgG2a NZ-1	免疫化学用		2 mL
溶液组成：1×TBS(pH 7.4), 50% glycerol, 0.05 w/v% sodium azide

产品名称	备注	规格	产品编号	包装
肽
PA标签肽 PA tag Peptide	含量（HPLC）95%以上	基因研究用		5 mg
PA标签肽 PA tag Peptide	含量（HPLC）95%以上	基因研究用		25 mg
清洗溶液
PA标签清洗溶液 PA tag Washing Solution	已过滤消毒即用型	基因研究用		50 mL

产品名称	可选Marker		产品编号	包装
产品名称	大肠杆菌	动物细胞	产品编号	包装
瞬时载体
pCAG-Ble PA 标签-C pCAG-Ble PA tag-C	Bleomycin			20 μg
pCAG-Ble PA 标签-N 信号增加型 pCAG-Ble PA tag-N Signal Plus	Bleomycin			20 μg
pCAG-Bsd PA 标签-C pCAG-Bsd PA tag-C	Blasticidin S			20 μg
pCAG-Bsd PA 标签-N 信号增加型 pCAG-Bsd PA tag-N Signal Plus	Blasticidin S			20 μg
pCAG-Neo PA 标签-C pCAG-Hyg PA tag-C	Hygromycin B			20 μg
pCAG-Hyg PA 标签-N 信号增加型 pCAG-Hyg PA tag-N Signal Plus	Hygromycin B			20 μg
pCAG-Neo PA 标签-C pCAG-Neo PA tag-C	Kanamycin	G418		20 μg
pCAG-Neo PA 标签-N 信号增加型 pCAG-Neo PA tag-N Signal Plus	Kanamycin	G418		20 μg

◆相关产品

内参照

下表为Western Blot实验中参照用单抗一览表。

产品名称	规格	产品编号	包装
抗β肌动蛋白单抗 Anti β-Actin, Monoclonal Antibody	免疫化学用		200 μg
			1 mg
			5 mg
抗β肌动蛋白单抗,过氧化物酶标记 Anti β-Actin, Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated	免疫化学用		200 μL
抗α-微管蛋白, 单抗 Anti α-Tubulin, Monoclonal Antibody	免疫化学用		10 μg
			200 μg
			1 mg
Anti β-Tubulin, Monoclonal Antibody 抗β-微管蛋白, 单抗	免疫化学用		10 μg
			200 μg
			1 mg
Anti GAPDH, Monoclonal Antibody 抗GAPDH, 单抗	免疫化学用		200 μg
			1 mg
			5 mg
Anti GAPDH, Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated 抗GAPDH, 单抗, 过氧化酶结合	免疫化学用		200 μL

蛋白酶抑制剂系列

产品名称	规格	产品编号	包装
蛋白酶抑制剂混合物试剂盒 I，无动物源成分（通用型） Protease Inhibitor Cocktail Set I, Animal-derived-free (for general use) (×100), Lyophilized	通用型		1 mL用
	通用型		1 mL用×5
蛋白酶抑制剂混合物试剂盒III, DMSO溶液（不含EDTA）（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set III, DMSO Solution (EDTA free) (×100)	动物细胞		1 mL
	动物细胞		1 mL×5
蛋白酶抑制剂混合物试剂盒V （无EDTA）（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set V (EDTA free) (×100), Lyophilized	2D电泳		1 mL
	2D电泳		1 mL×5
蛋白酶抑制剂混合物试剂盒 VI，DMSO溶液，用于植物（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set VI, DMSO Solution (for Plant) (×100)	植物细胞		1 mL
	植物细胞		1 mL×5
蛋白酶抑制剂混合物试剂盒VII，DMSO溶液，组氨酸标签蛋白（×100） Protease Inhibitor Cocktail Set VII, DMSO Solution (for Histidine-tagged Protein) (×100)	His Tag 纯化^※		1 mL
	His Tag 纯化^※		1 mL×5

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