谁说CRISPR不能做多重？双重CRISPR助力猴痘超敏快检！

猴痘是一种由猴痘病毒（MPVX）感染的病毒性人畜共患疾病。MPVX属于痘病毒科正痘病毒属，为基因组全长约197 kb的双链DNA病毒。感染猴痘病毒后，患者一般会出现高烧，头痛，背部疼痛，肌肉疼痛，淋巴结肿大，皮疹等症状。自2022年5月7日在英国诊断出一例MPVX病例以来，相继在世界各地出现患者，患病人数呈上升趋势。2023年9月15日，国家卫生健康委发布公告，自2023年9月20日起将猴痘纳入乙类传染病进行管理，采取乙类传染病的预防、控制措施。
猴痘病毒的暴发引起社会各界广泛关注，qPCR检测技术是目前检测猴痘病毒的唯一金标准，但其需要特定的仪器和环境，故，亟待出现一种可以在资源贫乏环境中应用的快速检测方法。安徽医科大学第一附属医院和安徽省公共卫生临床中心共同在题为“Creating an ultra‐sensitive detection platform for monkeypox virus DNA based on CRISPR technology”的文章中报道了一种基于CRISPR技术开发的猴痘病毒DNA超灵敏检测平台，利用Cas12a酶和Cas13a酶的切割特性进行双靶标检测，MPXV基因组最低检出限为10⁰ copies/μL，且特异性高，与其他痘科病毒、假病毒和细菌无交叉反应性。

01、方法建立

在本研究中作者设立了两步法和一管法两种检测方法（图1）。两步法检测：采集MPVX病人样本，RPA反应后取部分反应液至CRISPR双重反应体系中，Cas12a/crRNA复合物识别出DNA产物中F3L基因，被激发出反式剪切活性，使FAM标记的ssDNA探针断裂，释放FAM荧光信号。另一边Cas13a系统靶向的B6R基因通过T7体外转录转换为RNA靶标，激活Cas13a/crRNA复合物的反式剪切活性，导致ROX标记的ssRNA探针断裂，释放ROX荧光信号。如果使用试纸条层析进行该实验，则可以通过颜色变化直观检测出是否感染MPVX病毒。

一管法检测即先在PCR管底部进行多重RPA反应，CRISPR反应体系放在PCR管盖上，等PCR管底部RPA反应结束后，通过短暂离心使CRISPR反应体系掉落到管中继续进行反应。检测结果同样可以通过荧光信号进行判断。

                               图1.基于CRISPR双系统建立MPXV检测平台
02、CRISPR双系统的优化及建立

作者首先对CRISPR系统进行优化，验证了Cas12a对F3L基因的识别，并优化了不同浓度下Cas12a/crRNA对F3L的切割效率（图2A），建立了单管反应下CRISPR体系和RPA试剂最优反应体积（图2B）。与此同时，优化Cas13a/crRNA的体系对B6R基因的识别，明确体系中NTP mix为5 mM，T7 RNA聚合酶为4 U/μL时最优（图2C，2D）。最后，针对优化前后的体系进行对比验证（图2E，2F）。

                                 图2.CRISPR双系统优化

为建立双重CRISPR系统检测F3L和B6R基因，分别设计了FAM‐ssDNA‐BHQ1和 ROX‐ssRNA‐BHQ2探针，并通过实验验证在两步法和一管法中均可以检测出较强的荧光信号，二者具有良好的正交性（图3）。

                                    图3.双重CRISPR检测系统的建立

03、灵敏度和特异性评估

研究者单独对两步法中F3L和B6R基因检测，其检测下限为10⁰ copies/μL（图4A，4B）。一管法中Cas12a靶向的F3L基因检测下限在10² copies/μL（图4C），Cas13a靶向的B6R基因检测下限在10⁰ copies/μL（图4D）。随后对两种方法中的两种基因同时检测，发现检测下限与之前一致（图4E，4F）。在特异性评估中其特异性良好，无交叉反应（图4G）。

                                       图4.灵敏度和特异性评估
04、化学添加剂对一管法灵敏度提升

为解决Cas12a检测F3L基因一管法检测限比两步法高出2个数量级的问题，作者希望提升一管法检测的灵敏度。作者通过添加L -脯氨酸、尿素、甜菜碱、甘油和DMSO摸索其对Cas12a剪切的影响。在Cas12a剪切浓度为10⁵ copies/μL的样本时，加入化学添加剂，发现，0.1 mM L -脯氨酸、0.1 mM尿素、5%甘油对荧光信号有较好的提升作用（图5A，5B）。随后，在体系中补充BSA，对荧光信号值亦有提升（图5C，5D）。综合上述情况，作者同时添加了5%甘油和BSA，在10¹ and 10⁰ copies/μL体系下可检测出强荧光信号，并与两步法进行对比。最终，两者方法检出下限一致（图5E，5F）。作者将F3L和B6R基因检测下限与qPCR进行对比，发现加入化学添加剂优化后的CRISPR体系可达到与qPCR一致的检测灵敏度（图5G）。

图5.化学添加剂对一管法灵敏度的提升

05、试纸条层析实现可视化检测

为在试纸条上实现MPVX检测，根据试纸条层析的反应原理（图6A），分别设计了FAM-ssDNA‐Biotin和Dig‐ssRNA‐Biotin两条探针用于检测F3L和B6R基因，并调整相关实验体系，使Cas12a对F3L基因的检测灵敏度在10¹ copies/μL，Cas13a对B6R基因的检测灵敏度在10⁰ copies/μL（图6B-6E），同时，确保不出现假阳性结果，进行了特异性验证（图6F）。

图6.试纸条层析可视化检测

06、临床模拟阳性样本验证

作者采集模拟了临床病人不同类型的阳性样本，通过采集荧光信号和试纸条层析两种方法分别对8例阳性病人样本进行验证（图7A，7B），结果与qPCR一致（图7C）。说明建立的CRISPR双重检测系统可以检测MPVX临床样本。

图7.临床模拟阳性样本验证

总结

      本研究工作中作者通过建立双重CRISPR系统检测，利用Cas12a酶和Cas13a酶的切割特性进行双靶标检测，将MPXV的F3L和B6R基因最低检出限控制在10⁰ copies/μL、并实现了试纸条层析可视化快速检测。该简便、高灵敏的检测方法为贫困、条件艰苦地区进行猴痘病毒快速POCT检测提供了可能。相关产品

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