下一代分子诊断技术：CRISPR/Cas技术总结

近年来，以CRISPR/Cas为代表的基因编辑带来了生物技术革命性的进步，分别在2015和2017年两次被Science评为年度突破性科学进展之首，获评Nature近10年最具影响力的五大科学事件之首和2020年诺贝尔化学奖。短短几年时间，CRISPR技术成为科研界的热门内容，被称为下一代分子诊断技术！

CRISPR/Cas系统介绍:

     1987年，CRISPR 位点在细菌基因组中被发现，2002年CRISPR相关蛋白被发现，随后证实CRISPR-Cas系统是一种RNA引导的适应性免疫系统，可以抵御病毒、质粒等入侵遗传元素，其免疫过程大致可以分为三个阶段：适应、表达和干扰。

（1）适应阶段Cas蛋白识别并捕获外来核酸片段，获取新间隔序列，并整合插入自身CRISPR阵列，形成免疫记忆。

（2）表达阶段当外来核酸再次入侵时，从CRISPR阵列中相对应的间隔序列，转录出CRISPRRNA（crRNA）前体并加工获得小的、成熟的crRNA，其中包含一个保守的重复序列和一个间隔序列，crRNA进一步与一个或多个Cas蛋白相互作用，形成RN（ribonucleoprotein）复合体。

（3）干扰阶段Cas-crRNA复合体识别外来核酸，通过crRNA靶向目标核酸区域，介导Cas蛋白特异性地破坏入侵核酸。

CRISPR/Cas可分为二大类群：第1类以多个Cas组成的效应复合体行使功能为特征，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第2类则只需单个多结构域的Cas，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型。第2类系统简单、高效、操作方便，是目前主要的基因编辑系统，其中最具代表性的是Cas9。

 

 

                                                                                   Cas9编辑基因原理

     相比Cas9，Cas12a和Cas13a仅需crRNA 即可实现特异性靶位点切割，这表明其系统更为简洁，具有成为精度更高、安全性更好的新一代基因编辑工具的潜力。

基于Cas12a的分子检测系统:

      广泛应用于核酸检测的三种Cas12a蛋白包括LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a，其中LbCas12a的反式切割活性最强。2017年Jennifer Doudna团队开发了DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）检测技术，利用LbCas12a（Lachnospiraceae bacterium ND2006）与crRNA复合物，并在crRNA引导下利用RuvC结构域切割PAM（TTTN）序列下游18~25nt的靶DNA，在识别并切割靶标dsDNA的同时，激发Cas12a的反式切割活性，切割反应体系中的ssDNA报告分子。ssDNA报告分子标记有荧光基团和猝灭基团，一旦切割，荧光基团和猝灭基团被分离，就会产生稳定而强烈的荧光信号，荧光信号的强度可以指示检 测样本中靶标的量。此外，DETECTR还与重组酶聚合酶等温扩增技术结合（recombinase polymerase amplification，RPA），不仅提高了检测分析的灵敏度（amol/L水平），而且避免了对复杂、昂贵设备的需求。该技术现已成功应用于人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和SARS-CoV-2的检测。

 

                                         DETECTR检测方法原理图

2018年王金、赵国屏团队建立了HOLMES（one-hour lowcost multipurpose highly efficient system）检测技术，联合LbCas12a与PCR扩增，可以在1 h内完成对伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）和日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的检测，灵敏度可以达到1～10 amol/L，此外还可以准确区分病毒基因型以及人类的单核苷酸多态性 。但是，该技术联合PCR扩增提高稳定性的同时也增加了检测时间和设备依赖性。

基于Cas12b的分子检测系统:

    来源于嗜热菌的Cas12b含有单个RuvC结构域，脱靶效应低且同样具有反式切割活性。CRISPRCas12b是双RNA引导的DNA核酸内切酶系统，可以识别和切割靶向dsDNA或ssDNA，也可以非特异性切割ssDNA。当靶向dsDNA时，Cas12b依靠PAM序列（TTC或TAC）完成顺式切割。当靶向ssDNA时，Cas12b可不依赖PAM序列实现切割，而且切割活性高于dsDNA。

    根据这些特性，王金、赵国屏团队建立了升级版的HOLMESv2，将AacCas12b（Alicyclobacillus acidoterrestris）蛋白与环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）结合，只有含有5?-TTC-3?的dsDNA或切割后具有的5?-TAC-3?的DNA序列才能激活AacCas12b反式切割活性，该技术实现了DNA、RNA特异性检测以及区分SNP和定量DNA甲基化。

   2019年，Dai等开发了基于CRISPR-Cas12a的E-CRISPR检测技术，通过CRISPR-Cas系统来影响电信号输出，利用Cas12a的反式切割活性获得高传导信号。该检测技术将修饰有3′-亚甲基蓝（3′-MB）标签的ssDNA报告分子固定于金电极上，在靶DNA存在的情况下，Cas12a-crRNA反式切割MB-ssDNA分子，亚甲基蓝标签的分离，会使电化学信号降低。在没有靶标DNA存在时，Cas12a的反式切割活性保持沉默，ssDNA分子保留在电极表面，从而导致亚甲基蓝的高电化学电流。

                                                                               SHERLOCK检测方法原理

    2020年，Ding等开发了AIOD CRISPR（all-in-one dual CRISPR-Cas12a）检测技术，将RPA扩增和CRISPR检测的所有反应组分混合，在引入两个crRNA的同时，添加高浓度ssDNA报告分子，一步即可完成对SARS-CoV-2和HIV-1的检测。

基于Cas13的分子检测系统：

    Cas13是RNA引导和RNA靶向的核酸酶，具有两个HEPN结构域，特异性作用于RNA靶标。2017年，张峰团队开发了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）核酸检测技术。该技术与DETECTR原理相同，但依赖于LwaCas13a（Leptotirichia wadei）核酸酶的活性，识别和切割靶标RNA的同时，反式切割ssDNA报告分子产生荧光信号。

                                                                             SHERLOCK检测方法原理

   为了解决定量的问题，该团队开发了SHERLOCKv2，将4种类型的Cas蛋白（LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a）组合使用，切割用不同的荧光基团标记的报告分子，在FAM、Cy5、HEX和TEX通道中进行检测，实现了定量同时检测4种核酸序列。SHERLOCKv2也被应用于侧向流动分析，通过金纳米颗粒标记的抗FAM抗体，在试纸条上检测被切割的报告分子，产生视觉比色信号。

                                                   SHERLOCKv2 检测结果读取方式

    2020年，ACKERMAN等联合CRISPR诊断和微流控技术开发了CARMEN（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids）检测平台，该技术可以同时检测8个样本，169种人类相关病毒。但由于芯片定制成本高和检验操作流程复制，很难应用于临床。该团队在CARMENv.1的基础上开发了mCARMEN（microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids），将CRISPR诊断、微阵列技术与简化的临床工作流程相结合，开发的mCARMEN呼吸道病毒检测面板，可同时检测21种呼吸道病毒，包括SARS-CoV-2及其他冠状病毒、流感病毒等。