产地 | |
品牌 | 沃博生物 |
货号 | B8204C7 |
用途 | |
英文名称 | |
包装规格 | 48T |
纯度 | % |
CAS编号 | |
别名 | |
分子式 | |
是否进口 |
货号 |
名称 |
规格 |
存储 |
B8204C7 |
RNA恒温快速扩增试剂盒(RT-RAA基础型) |
48T |
-20℃ |
【产品用途】本产品可应用于核酸 RNA 的快速扩增。
【检测原理】本产品是基于重组酶介导链置换核酸扩增(Recombinase-aid Amplification,RAA)技术开发的恒温核酸扩增检测试剂,在42℃恒温条件下特异识别并扩增目标样本的RNA片段,用琼脂糖凝胶电泳检测判断。
【技术原理】重组酶介导链置换核酸扩增(Recombinase-aid Amplification,RAA),是一种恒温核酸快速扩增技术。 RT-RAA先利用逆转录酶将 RNA 逆转录成 cDNA,从细菌或真菌中获得的重组酶在常温下可与引物DNA紧密结合,形 成重组酶/引物复合体,侵入RNA-cDNA双链核酸模板,在侵入位点重组酶将双链打开,同时单链结合蛋白结合到被重 组酶打开的单链上,维持双链模板处于开链状态。重组酶/引物复合体开始对双链进行扫描,当引物在模板上搜索到与之完全匹配的互补序列时,重组酶/引物复合体解体,DNA聚合酶结合到引物的3’端,开始合成新链。合成的新链又可以作为模板,最终扩增产物以指数级增长,完成靶标基因的扩增。本试剂盒具有快速、灵敏度高以及特异性强等优点,反应组分已混合并冷冻干燥成反应干粉,操作简便,易于保存。
【引物设计】RAA核酸扩增技术对引物设计的要求与常规PCR引物设计有一定的区别。由两条寡核苷酸组成一对引物, 分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列;引物长度在30-35nt之间,序列中无回文序列、连续单碱基重复序 列和内部二级结构区;引物Tm值不作为设计时主要考虑因素;最佳引物对需通过试验优化筛选得到,要求其扩增产物为单一条带,无非特异性扩增和明显的引物二聚体。
建议:在开展RT-RAA (基础型)扩增反应之前,先进行引物的筛选试验, 以便得到较高的检测灵敏度。
【产品组成】
产品组成
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包装规格
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反应干粉
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8T/条×6 条
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A Buffer
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1.5 mL/管×1 管
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B Buffer
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200 μL/管×1 管
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使用说明书
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1份 |
【储存条件及有效期】本产品存储于-20±5℃、干燥、避光条件下;有效期为12个月。
【适用仪器】恒温金属浴、恒温水浴锅或恒温培养箱等。
【检测步骤】
1. RNA样本提取:请参考传统 Trizol 方法或其他同效商品化试剂盒提取RNA样本。
2. 样本检测
2.1 单管反应体系(50μL): 推荐反应体系(模板用量为5μL):
反应干粉 1 管 反应干粉 1 管
A Buffer 25 μL A Buffer 25 μL
上游引物(10 μM) 2.0 μL 上游引物(10 μM) 2.0 μL
下游引物(10 μM) 2.0 μL 下游引物(10 μM) 2.0 μL
RNA样本和水 18.5μL 水 13.5μL
B Buffer 2.5μL RNA样本 5 μL
B Buffer 2.5μL
总体积 50.0μL
总体积 50.0μL
2.2 操作步骤
2.2.1 根据反应数量,按照反应体系配制含有水、A Buffer、上游引物(10μM)、下游引物(10μM)的 Mix,混合均匀后加入装有反应干粉的检测单元管中;
2.2.2 向检测单元管中加入经步骤1处理得到的待测RNA样本;
2.2.3 再向检测单元管盖上加入2.5 μL 的B Buffer,盖上管盖,上下颠倒充分混匀5-6次,低速离心10sec; (注:本步骤“是否充分混匀”将决定实验结果的重复性)
2.2.4 将检测单元管放入42℃ 恒温金属浴(或恒温水浴锅、恒温培养箱等)中,孵育30min。
2.2.5 反应结束后,在检测单元管中加入50μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提液,充分混匀后12000rpm/min离心5min,取上清进行电泳检测。(此步骤除去反应体系中对电泳结果有影响的蛋白类成分)
【结果分析与判定】
使用凝胶成像仪进行图像采集和分析,对比扩增条带是否与目的片段大小一致。
【注意事项】
1. 在同一核酸提取方法下,不同样品类型所提取的核酸含量和纯度会有明显差异,导致扩增效率不同;
2. 当实验室环境、试剂、仪器或配件存在阳性物质(例如质粒、扩增产物等)污染,或样本间存在交叉污染的情况,则会影响检测结果准确性,出现假阳性结果;
3. 务必保证试剂保存、配制或运输得当,否则可能导致试剂检测性能下降,出现假阴性结果;
4. 请严格按照本说明书和基因扩增实验室的管理规范进行试验操作;
5. 实验结束后,检测过程中所产生的废弃物应按照相关规范进行处理。
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货号 |
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