OTSRC——一种硒增强的单管重组酶聚合酶扩增（Se-RPA）-CRISPR/Cas12a检测平台

发表时间：2026-02-28

宫颈癌作为女性系统高发恶性肿瘤，其防控意义远超疾病本身。重庆大学、四川大学等机构的研究团队开发了一种?硒增强的单管重组酶聚合酶扩增（Se-RPA）-CRISPR/Cas12a检测平台?，命名为?OTSRC?，用于?人乳头瘤病毒16型（HPV 16）DNA的超灵敏、低背景噪声检测?。该平台旨在解决传统等温扩增中存在的非特异性扩增问题，为宫颈癌筛查提供一种快速、高灵敏、高特异性的即时检测（POCT）方案。

一、核心原理与技术

1.?靶标基因?：针对HPV 16型高度保守的 ?L1基因?的部分序列进行检测。2.?创新点：硒修饰核苷酸（dNTPαSe）的引入?：在传统的RPA反应体系中，?掺入10%的硒修饰核苷酸三磷酸（dNTPαSe）?，替代部分普通dNTPs。作用机制?：o?抑制非特异性扩增?：dNTPαSe能竞争性抑制普通dNTPs的掺入，有效?抑制引物非依赖的DNA从头合成?，从而降低背景噪声。o?提高保真度?：硒原子较大的原子半径降低了DNA双链的热稳定性，并降低了DNA聚合酶的结合亲和力。这为聚合酶提供了更长的“校对”时间，使其能更有效地?识别并纠正错配的引物和错误掺入的核苷酸?，从而提高扩增的准确性和特异性。

二、单管集成设计?

采用创新的?单管物理分隔设计?：将?Se-RPA反应体系?置于管盖，?CRISPR/Cas12a检测体系?置于管底。

反应流程?：第一步（37°C, 10分钟）?：进行Se-RPA扩增，生成硒修饰的双链DNA（dsDNA）产物。第二步（离心混合）?：通过离心将管盖的RPA扩增产物转移至管底，与CRISPR体系混合。第三步（37°C, 10分钟）?：扩增产物激活Cas12a的反式切割活性，切割荧光报告探针（FAM标记），释放荧光信号。优势?：该设计实现了?真正的单管封闭反应?，极大降低了气溶胶污染风险，简化了操作。

其中，使用了沃博生物（warbio）的产品，CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条，货号JY0301。

三、方法开发与优化?

1.?体系构建与验证?：首先构建了传统的两步法RPA-CRISPR（TSRC）和单管RPA-CRISPR（OTRC）体系作为对比。通过荧光强度和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证了OTSRC体系的可行性，证明dNTPαSe的加入能显著降低背景信号（OTSRC的背景信号仅为OTRC的71.77%），同时产生硒修饰的扩增产物。

2.?关键参数优化?：dNTP浓度?：确定?20 μM?为OTRC体系中的最佳dNTP浓度。dNTPαSe比例?：确定?10%? 为OTSRC体系中dNTPαSe的最佳体积百分比。反应温度与时间?：优化后确定?Se-RPA和CRISPR反应均在37°C下进行10分钟?，总反应时间约20分钟。

四、性能评估?

1.?灵敏度?：

荧光检测模式?：OTSRC?：检测限（LOD）低至 ?169 aM?（阿摩尔，约10?1? 摩尔），线性范围为?100 aM 至 1 μM?。OTRC?：检测限为?340 aM?，线性范围为?1 fM 至 100 nM?。结论?：OTSRC的灵敏度是OTRC的?两倍?，且与金标准方法?实时荧光定量PCR（qPCR）? 的检测效果相当（qPCR检测限为100 aM）。

侧流层析试纸条（LFA）可视化模式?：OTSRC?：目视检测限为?100 fM?。OTRC?：目视检测限为?1 pM?。结论?：OTSRC的视觉检测灵敏度比OTRC?高一个数量级?。可视化检测的灵敏度比荧光检测低4-5个数量级，主要归因于固相输出端的信号损失。

OTSRC与OTRC结合侧流层析试纸条（LFA）检测10 fM ~ 10 μM HPV DNA

2.?特异性?：使用四种非特异性DNA序列（浓度100 nM）进行测试。结果显示，?仅HPV 16 DNA能产生高荧光信号，其他DNA的信号与背景无差异?。LFA测试也显示仅HPV DNA能在检测线（T线）产生红色条带。证明了OTSRC和OTRC均具有?优异的选择性?。
3.?重复性与再现性?：荧光检测?：OTSRC和OTRC的重复性实验相对标准偏差（RSD）分别为 ?4.589%? 和?3.793%?，表明?重复性良好?。LFA检测?：多次测试结果一致，显示?良好的再现性?。
4.?实际样本检测（抗干扰能力）?：将HPV 16 DNA加入20倍稀释的人血清中进行加标回收实验。OTSRC?：回收率在?81.28% 至 107.1%? 之间，RSD在 ?1.087% 至 3.457%? 之间。OTRC?：回收率在?94.91% 至 134.9%? 之间，RSD在 ?1.350% 至 4.732%? 之间。结论?：OTSRC在复杂生物基质中表现出?更优的准确度和精密度?，具备临床检测潜力。

五、方法优势与创新点?

1.?超低背景噪声与高灵敏度?：通过引入?dNTPαSe?，首创性地将硒化学修饰与RPA-CRISPR系统结合，?显著抑制了非特异性扩增，将检测背景噪声降低至传统体系的71.77%，并将灵敏度提升了一倍?。

2.?高保真度与特异性?：dNTPαSe增强了DNA聚合酶的“校对”能力，结合CRISPR/Cas12a序列特异性识别的?双重验证机制?，确保了检测的极高准确性。3.?快速单管封闭式操作?：整个检测流程仅需?约20分钟?，且在?恒温37°C?下完成。创新的单管物理分隔设计避免了开盖操作，?极大降低了污染风险?，适合现场应用。4.?经济高效?：反应总体积仅?14 μL?，仅使用试剂盒推荐标准体积的五分之一，?成本低廉?。5.?双模式输出?：兼容?实验室高灵敏荧光定量?和?现场可视化试纸条判读?，应用灵活。

六、结论与展望?

本研究成功构建了一种基于硒增强RPA与CRISPR/Cas12a集成的OTSRC检测平台。该平台实现了对HPV 16 DNA的?超灵敏（169 aM）、快速（20分钟）、高特异性、低背景噪声的检测?，其性能与qPCR相当，为宫颈癌的早期筛查，特别是在资源有限地区，提供了一种极具前景的POCT工具。
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