免疫磁分离-RPA-微流控检测技术，用于检测食源性致病菌及其耐药基因

副溶血性弧菌广泛存在于海产品、海洋及河口生态系统中，能够引发鳃腐病、虾红体病、早死综合征以及急性肝胰腺坏死病等多种水生物种疾病，给海水养殖业造成重大经济损失。我国水产养殖允许使用氟苯尼考以及部分磺胺类和喹诺酮类抗生素。由于缺乏严格的监控与管理，抗生素滥用加剧了海水养殖环境中副溶血性弧菌的抗菌素耐药性问题。近年来，等温核酸扩增方法在食源性致病菌和耐药基因（ARGs）检测中的应用明显增加。重组酶聚合酶等温扩增（RPA）技术能在温和的温度条件下，在5-20分钟内将目标核酸扩增至可检测水平。然而，气溶胶交叉污染风险阻碍了RPA在现场开放环境的应用。

具有高通量和自动化操作能力的微流控技术，能够整合样品处理、核酸扩增和检测过程至单一芯片中。其中，离心式微流控芯片利用离心力通过微通道将样品及反应体系均匀分布于检测微孔内，最大程度的降低交叉污染的风险，在食源性细菌及ARGs现场检测方面展现出巨大潜力。近日，中国计量大学蒋晗副教授和吕晨泽副教授研究团队开发了一种快速、准确的免疫磁分离（IMS）-RPA-微流控检测技术，集成样品浓缩、核酸提取及等温扩增步骤，实现副溶血性弧菌及相关ARGs的实时监测，相关研究成果以“Simultaneous detection of Vibrio parahemolyticus and antimicrobial resistance genes using immonomagnetic separation combined with RPA-microfluidic method in seafood”为题发表于高水平期刊Food Control。该研究利用优化后的IMS技术完成样品的预处理和靶向富集，采用创新设计的离心微流控芯片检测副溶血性弧菌及其floR、sul1和qnrA基因。与传统检测方法相比，该技术对实验条件和操作人员的要求明显降低，为现场快速监测食源性微生物及其ARGs的挑战提供可行的解决方案。

图1 免疫磁分离（IMS）技术联合RPA-微流控法同时检测海产品中副溶血性弧菌及其耐药基因的操作流程及原理示意图。

该研究使用的微流控芯片为直径80毫米、厚度2.5毫米的紧凑圆盘结构，包含8个独立单元，每个单元均设有1个样品孔、1个排气口和4个微反应室。每个微反应室内预先装载扩增体系混合物。位于微反应室前的球阀负责确保反应混合物能够顺利转移并填充反应室完成核酸扩增及检测。在检测时，通过微流控芯片的样品孔注入样品液，随后使用密封膜对样品孔进行封闭。然后，将组装好的微流控芯片置入检测装置中。样本液通过离心力均匀分布于各个反应室内，在设定温度下进行实时荧光RPA反应。检测装置收集和处理每个反应室的荧光信号，最终获得样品液的实时扩增曲线。